表觀遺傳修飾在多種生物和病理過程中起著關(guān)鍵作用，其中５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ）被認為是腫瘤發(fā)生和進展的早期分子事件，并已成為一個非常有前景的生物標志物。近年來，５－羥甲基胞嘧啶（５ｈｍＣ）作為５ｍＣ的氧化產(chǎn)物，在正常哺乳動物生長和發(fā)育中也扮演著重要角色，并與癌癥和神經(jīng)疾病等疾病相關(guān)，顯示出作為癌癥診斷理想生物標志物的巨大潛力。然而，由于５ｈｍＣ水平比５ｍＣ低約１４倍，且其結(jié)構(gòu)與Ｃ和５ｍＣ相似，使得５ｈｍＣ的定量檢測更具挑戰(zhàn)性。

近日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院彭小煥博士為第一作者、徐宏研究員為通訊作者在《Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ》期刊發(fā)表題為＂Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?。眩酰幔睿簦椋妫椋悖幔簦椋铮睢。铮妗。担瑁恚谩。猓。瘢校茫摇。觯椋帷。帷。茫铮恚猓椋睿幔簦椋铮睢。铮妗。牛睿恚幔簦椋恪。模椋纾澹螅簦椋铮睢。幔睿洹。模澹幔恚椋睿幔簦椋铮睿骸。牛簦颍澹恚濉。樱穑澹悖椋妫椋悖椋簦?，?。龋椋纾琛。樱澹睿螅椋簦椋觯椋簦。幔睿洹。茫欤椋睿椋悖幔臁。粒穑穑欤椋悖幔猓椋欤椋簦⒌目蒲谐晒?，研究建立了一種名為ＥＤＤ－５ｈｍＣ的５ｈｍＣ定量方法，該方法通過結(jié)合酶切（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ?。模椋纾澹螅簦椋铮睿┖蜕锩摪保ǎ模澹幔恚椋睿幔簦椋铮睿┎呗裕茫瘢校茫移脚_實現(xiàn)對片段特異性ＤＮＡ序列中５ｈｍＣ的極高特異性、高靈敏度和臨床適用性的定量分析。該方法首次在結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁組織中檢測了５ｈｍＣ水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，結(jié)果顯示單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的ＲＯＣ曲線下面積高達８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的ＲＯＣ曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準確定量５ｈｍＣ水平的方法。

標題：Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?。铮妗。担瑁恚谩。猓。瘢校茫摇。觯椋帷。帷。茫铮恚猓椋睿幔簦椋铮睢。铮妗。牛睿恚幔簦椋恪。模椋纾澹螅簦椋铮睢。幔睿洹。模澹幔恚椋睿幔簦椋铮睿骸。牛簦颍澹恚濉。樱穑澹悖椋妫椋悖椋簦?，?。龋椋纾琛。樱澹睿螅椋簦椋觯椋簦?，?。幔睿洹。茫欤椋睿椋悖幔臁。粒穑穑欤椋悖幔猓椋欤椋簦ㄍㄟ^結(jié)合酶切和脫氨作用的ｑＰＣＲ對５ｈｍＣ片段特異性定量檢測：極高特異性、高靈敏度和臨床適用性）

期刊：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ?。茫瑁澹恚椋螅簦颍?/p>

日期：２０２５－１－１３

技術(shù)平臺：擴增子ＡＰＯＢＥＣ偶聯(lián)ＤＮＡ羥甲基化測序（ＡＣＥ－ｓｅｑ）、ｑＰＣＲ等

準確鑒定和定量５ｈｍＣ有助于闡明其在基因表達和疾病發(fā)病機制中的功能，目前的５ｈｍＣ分析方法在臨床應(yīng)用中，存在假陽性結(jié)果的風(fēng)險以及靈敏度不足的問題。本研究建立了一種靶向片段特異性ＤＮＡ序列的５ｈｍＣ定量方法，該方法具有極高的特異性、高靈敏度和臨床適用性－－ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法，該方法通過酶切富集糖基化的５ｈｍＣ，然后利用ＡＰＯＢＥＣ（載脂蛋白Ｂ?。恚遥危辆庉嫶呋嚯臉樱┙閷?dǎo)的脫氨基作用，有效區(qū)分各種胞嘧啶（Ｃ）修飾狀態(tài)，實現(xiàn)了極高特異性的５ｈｍＣ定量，使非特異性擴增減少８Ｍ倍。此外，ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的非破壞性生物處理過程表現(xiàn)出高靈敏度，最低檢出限（Ｌｉｍｉｔ?。铮妗。模澹簦澹悖簦椋铮睿蹋希模┻_到３０?。幔汀Ｑ芯咳藛T利用該方法首次檢測了結(jié)直腸癌組織和匹配的癌旁組織中的５ｈｍＣ水平，以評估其區(qū)分結(jié)直腸癌的能力，單基因Ｓｅｐｔｉｎ９的受試者工作特征曲線下面積高達８２．８％，Ｓｅｐｔｉｎ９和Ｓｙｎｄｅｃａｎ－２（ＳＤＣ２）組合的曲線下面積為８３．６％，表明ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法是一種具有臨床應(yīng)用前景的準確定量５ｈｍＣ水平的方法。

研究摘要

研究方法

研究中基于ＡＣＥ－ｓｅｑ分析提出的ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法包括四個步驟：

（１）通過Ｔ４－β－葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（Ｔ４?。拢牵裕┖湍蜍斩姿崞咸烟牵ǎ眨模校咸烟牵┓磻?yīng)，對５ｈｍＣ進行高效無損傷的葡萄糖基化，生成５ｇｈｍＣ；

（２）應(yīng)用葡萄糖基－５－羥甲基胞嘧啶敏感的限制性內(nèi)切酶（ＧＳＲＥｓ）消化Ｃ和５ｍＣ，富集完整的５ｇｈｍＣ目標；

（３）通過ＡＰＯＢＥＣ脫氨基將Ｃ和５ｍＣ轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（Ｕ），而５ｇｈｍＣ仍被讀作Ｃ；

＊以上３步驟均為ＡＣＥ－ｓｅｑ測序的基本原理

（４）使用特異性引物和ＴａｑＭａｎ探針結(jié)合并擴增５ｇｈｍＣ以產(chǎn)生熒光信號。該方法基于ｑＰＣＲ平臺，通過酶切和脫氨基的雙重作用，有效地區(qū)分５ｈｍＣ與Ｃ和５ｍＣ，確保了極高的特異性和靈敏度。

研究結(jié)果

• 特異性和靈敏度：ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法通過四組不同預(yù)處理的人工合成線性雙鏈ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）驗證了其特異性，結(jié)果顯示該方法能夠顯著減少非特異性擴增，將非特異性擴增減少了超過八百萬倍，檢測限達到３０?。幔?。

• 臨床樣本驗證：使用未甲基化ＨＣＴ１１６?。模耍稀。纾模危?、甲基化ＨＣＴ１１６?。纾模危梁腿四X基因組作為模型樣本，選擇了ＥＧＦＲ基因作為目標基因進行驗證。結(jié)果顯示，只有經(jīng)過Ｔ４?。拢牵裕粒校希拢牛没颍裕础。拢牵裕停螅穑桑粒校希拢牛寐?lián)合處理的人腦基因組產(chǎn)生了特異性ＰＣＲ擴增。

• 臨床診斷性能：對２５例結(jié)直腸癌患者和配對的癌旁組織樣本進行分析，結(jié)果顯示Ｓｅｐｔｉｎ９基因的５ｈｍＣ水平在ＣＲＣ組織中顯著高于非腫瘤組織（Ｐ?。肌。埃埃埃埃保?，表明Ｓｅｐｔｉｎ９基因的特定片段５ｈｍＣ水平有潛力作為ＣＲＣ的診斷標志物（ＡＵＣ?。健。埃福玻福?。

ＡＣＥ－ｓｅｑ在本研究中的作用

ＡＣＥ－ｓｅｑ（ａｍｐｌｉｃｏｎ?。粒校希拢牛茫悖铮酰穑欤澹洹。澹穑椋纾澹睿澹簦椋恪。螅澹瘢酰澹睿悖椋睿纾┰诒狙芯恐杏糜诖_定ＨＣＴ１１６細胞中與Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２相關(guān)的５ｈｍＣ信息，以及ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)。這些信息對于選擇特定的ＤＮＡ片段進行ＥＤＤ－５ｈｍＣ分析至關(guān)重要，確保研究中所使用的ＤＮＡ片段具有高ＤＮＡ甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（ＣＲＣ）強相關(guān)。通過ＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的數(shù)據(jù)為ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法的驗證和應(yīng)用提供了準確的５ｈｍＣ修飾信息，從而提高研究的準確性和可靠性。

重要圖形

（１）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ表征ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)

為了檢驗ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對實際樣本的可行性，選擇三種模型樣本進行驗證：未甲基化的ＨＣＴ１１６?。模耍稀。纾模危粒p敲除）、甲基化的ＨＣＴ１１６　ｇＤＮＡ和人類大腦基因組。首先選擇在人類大腦基因組中富含５ｈｍＣ的表皮生長因子受體（ＥＧＦＲ）基因作為目標基因，對選定檢測片段的基因組進行ＣｐＧ島預(yù)測，并通過（ａｍｐｌｉｃｏｎ　ＡＰＯＢＥＣ偶聯(lián)表觀遺傳測序）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ對ＥＧＦＲ基因片段的５ｈｍＣ狀態(tài)進行表征。測序結(jié)果顯示，ＥＧＦＲ片段（ｃｈｒ７：５５０８２６１０?５５０８２７２４，稱為ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ?。叮福叮常担┰谌祟惔竽X基因組中高度富集（平均４４．５６％），而在未甲基化的ＨＣＴ１１６　ＤＫＯ?。纾模危梁图谆模龋茫裕保保丁。纾模危林泻枯^低（平均分別為０．１８％和０．６６％）。

圖１：用于ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測的候選ＥＧＦＲ位點。

（２）ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定ＨＣＴ１１６細胞中目標位點對應(yīng)的５ｈｍＣ信息

通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ確定了ＨＣＴ１１６細胞中位點對應(yīng)的５ｈｍＣ信息，最終選定的序列片段為ｃｈｒ１７：７７３７３３４２?７７３７３４３７、ｃｈｒ８：９６４９４０９３?９６４９４２１５和ｃｈｒ８：９６４９４０３９?９６４９４１１１，分別命名為Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２　３１３和ＳＤＣ２?。玻常?，這些片段位于研究團隊先前研究中鑒定的高ＤＮＡ甲基化富集區(qū)域，與結(jié)直腸癌（ＣＲＣ）強相關(guān)。

圖２：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法中使用的Ｓｅｐｔｉｎ９（Ａ）、ＳＤＣ２?。常保常ǎ拢┖停樱模茫病。玻常梗ǎ茫┑淖罱K選定位點。

（３）ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能和臨床診斷性能

為了評估ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的靈敏度，通過２倍系列稀釋ＨＣＴ１１６基因組ＤＮＡ來評估已建立檢測法的分析性能，其中羥甲基化ＤＮＡ的理論ｉｎｐｕｔ拷貝數(shù)通過ＡｍｐＡＣＥ－ｓｅｑ獲得的５ｈｍＣ比例計算得出。分析結(jié)果表明，對于Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２?。常保澈停樱模茫病。玻常?，隨著羥甲基化ＤＮＡ濃度降低，Ｃｔ值逐漸增加。羥甲基化拷貝數(shù)與Ｃｔ值之間的關(guān)系分別為Ｒ2＝０．９９、Ｒ2＝０．９９和Ｒ2＝０．９５，這突出了ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的定量分析能力。

使用含有１０、１０和３０個拷貝／反應(yīng)的Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２?。常保澈停樱模茫病。玻常沽u甲基化ＤＮＡ的樣本，進行了２０次重復(fù)檢測，以研究已建立檢測法的ＬｏＤ。結(jié)果表明在２０次重復(fù)反應(yīng)中，Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２?。常保澈停樱模茫病。玻常钩赎栃缘母怕史謩e為９５％、１００％和１００％，表明Ｓｅｐｔｉｎ９、ＳＤＣ２　３１３和ＳＤＣ２?。玻常沟臋z測靈敏度分別約為１０、１０和３０個拷貝／反應(yīng)，得出的ＬｏＤ約為３０　ａＭ，高于先前報道１１３．７?。幔挽`敏度的５ｈｍＣ檢測方法。因此，本研究建立優(yōu)化后的ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法表現(xiàn)出高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

圖４：ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法對Ｓｅｐｔｉｎ９和ＳＤＣ２的分析性能。

易小結(jié)

ＥＤＤ－５ｈｍＣ檢測法的建立，能夠在ｑＰＣＲ平臺上以極高的特異性和高靈敏度準確定量特定片段的５ｈｍＣ水平。該方法顯著減少了假陽性信號，提高了檢測靈敏度，實現(xiàn)了約３０?。幔偷淖畹蜋z出限（ＬｏＤ）。同時，該方法首次證明了檢測單個基因Ｓｅｐｔｉｎ９中的特定５ｈｍＣ片段作為ＣＲＣ的新表觀遺傳生物標志物的巨大潛力，其ＡＵＣ高達８２．８％。未來，通過擴展其應(yīng)用到其他疾病和研究更多標志物，ＥＤＤ－５ｈｍＣ方法可能為與５ｈｍＣ水平差異相關(guān)的疾病提供有效的臨床檢測和驗證研究的新工具。

參考文獻：

Ｐｅｎｇ　Ｘ，　ｅｔ?。幔欤。疲颍幔纾恚澹睿簦螅穑澹悖椋妫椋恪。眩酰幔睿簦椋妫椋悖幔簦椋铮睢。铮妗。担瑁恚谩。猓。瘢校茫摇。觯椋帷。帷。茫铮恚猓椋睿幔簦椋铮睢。铮妗。牛睿恚幔簦椋恪。模椋纾澹螅簦椋铮睢。幔睿洹。模澹幔恚椋睿幔簦椋铮睿骸。牛簦颍澹恚濉。樱穑澹悖椋妫椋悖椋簦?，?。龋椋纾琛。樱澹睿螅椋簦椋觯椋簦?，　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ?。粒穑穑欤椋悖幔猓椋欤椋簦。粒睿幔臁。茫瑁澹恚。玻埃玻怠。剩幔睢。保常。洌铮椋骸。保埃保埃玻保幔悖螅幔睿幔欤悖瑁澹恚矗悖埃担保矗罚。校酰猓停澹洹。校停桑模骸。常梗福埃矗玻保矗?/p>

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